在miRNA的研究中，验证miRNA与基因靶向关系是一个常见而重要的环节。miRNA通过其种子序列（即5’端第2-8个碱基）靶向结合mRNA的3'UTR区域，进而诱导细胞内的沉默复合体介导mRNA降解或抑制其翻译过程。在这一原理的基础上，可以将目的基因的3'UTR（或结合位点下游500bp）插入到荧光素酶报告基因载体luciferase的下游，并与miRNA模仿物共转染于目标细胞中。随后添加底物，以检测荧光素酶活性的变化。如果观察到荧光素酶活性下降，便意味着该miRNA与靶基因的3'UTR之间存在相互作用。

双荧光素酶报告基因检测的工作原理主要基于以下步骤：首先利用生物信息学分析工具（如TargetScan、StarBase和miRanda）预测miRNA靶基因的3'UTR序列是否具有miRNA结合位点。将预测中能够与miRNA结合的靶基因3'UTR序列插入到火fly荧光素酶的3'UTR中。当miRNA与质粒中的插入序列结合时，miRNA通过与插入序列的结合抑制火fly荧光素酶的翻译，最终导致荧光值降低。

在miRNA与靶基因相互作用的结构学验证中，实验步骤和结果分析可以有效验证miRNA与靶基因3'UTR的相互作用，进而为研究miRNA的功能和调控网络提供重要工具。

人生就是博-尊龙凯时 为您提供的双荧光素酶报告基因检测服务流程包括以下详细操作步骤：

材料与准备

• 细胞：HEK293细胞或特定目标细胞
• 转染试剂：可选用HieffTrans® invitro siRNA/miRNA Transfection Reagent（货号：40806ES）
• 报告基因检测试剂盒：Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit（货号：11402ES）
• 其他：酶标仪、细胞培养板等实验耗材

实验步骤

在进行验证实验时，为了确保结果的准确性，首先要确认目的细胞的质粒转染效率，建议在质粒转染效率达到40%以上时，可以开始实验。

1. 将健康的处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化，并用完全培养基悬浮成单细胞悬液，计数后接种于24孔培养板中。
2. 培养过夜并观察细胞状态，当细胞覆盖率达到约70%时，进行转染实验。
3. 转染前2小时更换为新鲜培养基。
4. 在无菌的15mL EP管中进行转染，具体参考转染试剂的使用说明书。
5. 转染48小时后收集细胞样品。

收集细胞样品时，轻轻吸去培养液，PBS洗涤两次，然后加入100μL的1×PLB液，细胞裂解后将样品转移至EP管，保存于-80°C冰箱中。

根据报告基因检测试剂盒的说明进行检测，包括离心和配置Renilla荧光素酶检测试剂等。

实验预期结果是通过上述步骤，能够有效验证miRNA与靶基因3'UTR的相互作用，加速基础研究和药物筛选进程，助力科研更进一步。

人生就是博-尊龙凯时致力于为您提供高质量的科学研究服务，帮助您取得更优秀的研究成果。