mRNA技术作为一种新兴的生物技术，具有广泛的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，这一技术为疾病预防和治疗提供了创新的思路。然而，mRNA技术的发展并不平坦，其中最大的挑战之一便是副产物双链RNA（dsRNA）的形成。dsRNA作为一种免疫刺激分子，会引发机体的免疫反应，从而影响mRNA的安全性和有效性。因此，减少dsRNA的形成成为mRNA技术领域亟需解决的关键问题。

传统的解决方案依赖于复杂的纯化工艺，但这些工艺成本高、效率低，且难以彻底去除微量dsRNA。T7RNA聚合酶（T7RNAP）作为mRNA体外转录（IVT）的核心工具酶，其天然活性（如末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性）被认为是dsRNA形成的重要因素。因此，如何通过定向进化或理性设计改造T7RNAP，已成为全球科研团队关注的焦点。

在2024年3月3日，我们的团队在FEBS Journal上发表了题为《Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities》的研究论文。我们成功地通过工程化改造T7RNAP，显著降低了体外转录过程中dsRNA的生成（仅为野生型的18%），同时大幅提升了合成mRNA的整体效率和质量，推动了基因治疗和疫苗开发领域的突破性进展。

我们创新性地结合定向进化和半理性设计的方法，成功筛选出多个高效低毒的T7RNAP突变体，这些突变体在减少dsRNA形成方面表现良好。我们构建了随机突变库，并设计了一种能够实时监测液滴内RNA产品的完整性与dsRNA含量的分子信标探针系统，结合荧光激活液滴分选（FADS）技术进行超高通量筛选。最终成功筛选出关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T），它们产生的dsRNA含量显著低于野生型。

此外，我们通过半理性设计构建了十个单点饱和突变库，并利用微孔板筛选技术识别出有益的突变体。筛选结果显示，突变体Mut11（K180E）和Mut14（A70Q）产生的dsRNA含量显著低于野生型且未影响转录效率。为了进一步优化，我们针对这些突变位点构建了DNA打乱（shuffling）文库，通过微孔板筛选，最终获得组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E）。实验表明，M17的dsRNA含量仅为野生型的18%，在筛选体系中仅为0.007 ng/μg。

这一成果不仅在体外实验中验证了其有效性，还在细胞实验中展现出显著减轻的免疫原性和提升的蛋白翻译效率。我们将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞后，最优突变体M11产物引发的干扰素β（IFN-β）mRNA和蛋白表达量分别为野生型的97%和1293 pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数显著增加，且荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA能够有效解除PKR介导的翻译抑制，从而释放mRNA治疗的潜力。

为了深入了解这些突变体降低dsRNA的作用机制，我们通过计算机模拟与功能实验揭示了突变体因降低RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性而减少dsRNA的生成，这一发现为未来优化T7RNAP提供了重要的理论支持。

本研究为T7RNAP的改造开辟了新的方法与思路，也为mRNA技术的发展注入了新活力，显著提高了mRNA的质量和安全性。基于这项研究成果，我们推出了一款大幅降低dsRNA含量的GMP级别T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7RNA聚合酶GMP级（低dsRNA，250U/μL））。该产品在mRNA疫苗和药物等领域显示出广泛的应用潜力，期待推动mRNA技术更进一步的发展，为生物医学领域带来更多可能性。这一切都让人生就是博-尊龙凯时焕发出新的生机。

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